Kontrola endotoxinů a sterility u výzkumných peptidů
Endotoxin je častým a snadno přehlédnutelným důvodem, proč experimenty s peptidy přinášejí nespolehlivá data, především v buněčných kulturách. HPLC může peptid ohodnotit jako 99% čistý, a přesto může obsahovat tolik endotoxinu, že zkreslí výsledek.
Tento návod vysvětluje, co jsou endotoxiny, proč na nich záleží, jak je laboratoře měří a jak číst řádky o endotoxinech a sterilitě, které uvidíte na certifikátu.
Na této stránce
Endotoxiny ve zkratce
Endotoxiny jsou lipopolysacharidy (LPS), velké molekuly nacházející se ve vnější membráně gramnegativních bakterií. Uvolňují se, když bakterie odumírají a rozpadají se. Klíčové je, že endotoxiny jsou tepelně stabilní a chemicky odolné. Usmrcení bakterií nebo jejich odfiltrování endotoxin neodstraní.
Proto může být vzorek sterilní, bez čehokoli živého, a přesto obsahovat endotoxin. Jde o dva různé problémy a každý z nich vyžaduje vlastní test.
Proč na nich v laboratoři záleží
Endotoxiny silně aktivují imunitní systém. Při práci s buněčnými kulturami a v imunologii mohou nepatrná množství spustit uvolňování cytokinů, zapnout signální dráhy a posunout experimentální výstupy. Kontaminovaný peptid tak vnáší proměnnou nesouvisející se zkoumanou látkou a bez testu ji nikdo nevidí. V citlivé práci patří vyloučení endotoxinu k nejdůležitějším kontrolám, které můžete provést.
Měření endotoxinu: test LAL
Standardní metodou je test LAL (Limulus Amebocyte Lysate). Jeho reagencie reaguje za přítomnosti endotoxinu. Výsledky se uvádějí v endotoxinových jednotkách na miligram (EU/mg). Nižší hodnoty jsou lepší. Prosazuje se verze bez živočišných složek založená na rekombinantním faktoru C; měří totéž.
Testování sterility
Testování sterility je jiná kontrola. Hledá životaschopné bakterie a houby a obvykle se uvádí jako vyhověl nebo nevyhověl. Při společném čtení popisují výsledky sterility a endotoxinů mikrobiální kvalitu mnohem lépe než kterýkoli z nich samostatně.
Kde najít výsledky v CoA
Na certifikátu hledejte dva řádky: hodnotu endotoxinu v EU/mg a výsledek sterility vyhověl/nevyhověl. Nižší hodnota EU/mg znamená čistší materiál. Protokol, který obsahuje obojí, chrání vaše data lépe než takový, který uvádí jen čistotu a nic dalšího. Ke zbytku dokumentu viz náš návod ke čtení analytického certifikátu (CoA) peptidu.
Údaje o endotoxinech v NordPeps
Certifikáty od nezávislé laboratoře třetí strany zveřejňujeme pro každou šarži na naší stránce certifikátů, jakmile jsou k dispozici. Pokud certifikát obsahuje výsledky endotoxinů nebo sterility, najdete je tam, uvedené u šarže, které se týkají.
Časté otázky
Testování sterility a testování endotoxinů: jaký je rozdíl?
Test sterility hledá živé bakterie a houby. Test endotoxinů měří bakteriální toxiny (lipopolysacharidy), které přežijí zahřátí a mohou přetrvávat i po odumření bakterií. Sterilní vzorek může stále obsahovat endotoxin, proto jsou potřeba oba testy.
Co je EU/mg?
Endotoxinové jednotky na miligram. Je to hodnota, kterou poskytuje test LAL, a kvantifikuje kontaminaci endotoxinem. Nižší číslo znamená čistší materiál.
Když je peptid 99% čistý, proč se zabývat endotoxinem?
Čistota podle HPLC se týká peptidové frakce. Mikrobiální kontaminanty nezachytí. Peptid s 99% čistotou může stále obsahovat endotoxin a samotný tento endotoxin může zkreslit experimenty s buněčnými kulturami a imunologické experimenty.